Клиника «Семейная медицина» НИИ промышленной и морской медицины МЗ РФ и иммунологическая лаборатория Центра МЧС, Санкт-Петербург

Введение

По данным Лионского регистра, основанных на изучении 1200 историй болезни, рассеянный склероз определяется как идиопатическое воспалительное заболевание центральной нервной системы. Ведущим механизмом воспаления является иммунопатологический, опосредованный Т-лимфоцитами. В настоящее время внимание исследователей сосредоточено на иммунологических медиаторах воспаления – цитокинах. Цитокины могут вырабатываться многими клетками организма, в том числе и клетками ЦНС, что особенно важно в представлении антигенных детерминант миелина иммунокомпетентным клеткам.

При активной демиелинизации вокруг «свежей» бляшки рассеянного склероза расположены макрофаги и астроциты продуцирующие провоспалительный цитокин ФНО-альфа ( Selmaj K,1991), который имеет много биологических эффектов, в том числе усиление перекисного окисления, стимуляцию продукции гамма-ИФН Т-лимфоцитами и апоптоз олигодендроцитов производящих миелин. Это позволило говорить о возможном лечении рассеянного склероза анти-ФНО фактором (Selmaj .,1991). Повышение продукции ФНО-альфа регистрируется за 5-14 дней до клинического обострения заболевания, что позволяет называть этот цитокин наиболее точным маркером активации патологического процесса при РС (Е.И.Гусев, 1997).Другим важным фактором развития иммунного воспаления при РС является гамма-ИФН, который продуцируется Т-хелперами 1-го типа ( Th -1) и усиливает экспрессию молекул адгезии и, следовательно, способствует проникновению активированных клеток через ГЭБ в ткань мозга. Гамма-ИФН усиливает продукцию ФНО-альфа и оба цитокина имеют потенцирующий друг друга эффект. Подавляют действие гамма-ИФН другие ИФН, а именно, бета-ИФН. На этом основано одно из наиболее перспективных направлений иммунномодулирующего лечения РС (Miller , 1996)  и уже выпускаются препараты бета-интерферона.

Люди генетически способные к быстрой индукции гамма-ИФН и заболевшие РС могут иметь частые вирусиндуцированные обострения заболевания. Люди слабоиндуцирующие интерфероны и заболевшие РС будут иметь обострения, связанные со стрессорными факторами больше влияющими на уровень ФНО-альфа. ФНО-альфа представляется более универсальным провоспалительным цитокином, чем гамма-ИФН. Разумеется, при развившемся обострении РС оба цитокина «работают» вместе. Параллельно с каскадом воспалительных реакций происходят и противовоспалительные события, в частности Т-хелперами 2-го типа ( Th -2) продуцируется цитокин интерлейкин-10(ИЛ-10), подавляющий ФНО-альфа. ИЛ-10 продуцируется также и В-лимфоцитами, поэтому для ремиттирующего РС характерен В-лимфоцитоз. В эксперименте на мышах введение ИЛ-10 за два дня до иммунизации и в течение 5 дней после подавляло развитие ЭАЭ (Nagelkerken L ., 1995) У лиц с высоким содержанием клеток с маркером CD 8 (супрессорами) хорошо вырабатывается другой противовоспалительный цитокин трансформирующий ростовой фактор бета (TGF - beta), подавляющий эффекты как ФНО-альфа, так и гамма-ИФН (Sasaki H .,1992). Повышение продукции противовоспалительных цитокинов является механизмом ремиссии при РС ( Navikas V .,1995) и характерно для легкого и стабильного течения заболевания ( Link J . et all .,1994). Индуцировать   TGF - b  можно пероральным препаратом миелина. При этом увеличивается количество супрессоров CD 8 (Chen Y . et  all .,1994).

Исходя из вышесказанного, естественно, что разрабатывая современные схемы лечения РС и испытывая новые иммунотропные препараты, необходимо включать в критерии оценки их эффективности способность подавления ими эффектов ФНО-альфа и ИФН - гамма.

Материал и методы

С этой целью нами использован отечественный препарат Амиксин – производное флуорена (2.7 би / 2-(диэтиламино)-этокси / флуорен-9-ОН дигидрохлорид - производства фирмы Лэнсфарм (Москва) в виде таблеток элипсоидной формы, покрытых желтой кишечнорастворимой оболочкой.

Препарат использовался по 0,125 через 48 часов Х 10 с общей курсовой дозой 1,25.

  Клинический материал составили 42 пациента с легкой и средней степенью тяжести церебро-спинальной формы РС (14 мужчин и 28 женщин) в возрасте от 17 до 42 лет (31,5+/-7,0) с давностью заболевания от 1 года до 12 лет (8,3+/-3,5). Все больные находились в фазе неустойчивой ремиссии и до обследования перенесли от 3-х до 8 обострений заболевания. Диагноз подтвержден с помощью МРТ головного мозга выявлением фокусов демиелинизации в диаметре не менее 6 мм расположенных перивентрикулярно и не менее одного очага - субтенториально. Степень двигательных ограничений по Куртцке составляла 3-4,5 балла. Оценка неврологического статуса по Позеру находилась в пределах от 85 до 110 баллов. Последние 3 мес до назначения Амиксина больные не получали глюкокортикоидных, иммунодепрессантных или интерфероновых препаратов.

  Использовался метод клинического наблюдения с производством иммунологических анализов характеризующих состояние клеточного иммунитета, цитокинового и интерферонового статуса, а также степень сенсибилизации лейкоцитов к основному белку миелина (ОБМ) в реакции торможения адгезии лейкоцитов и РТМЛ. Анализы и неврологическое обследование производилось до и после курса Амиксина. Исследование ФНО-альфа и ИЛ-10 повторялось еще через две недели после завершения лечения.

Амиксин как модулятор цитокиновых реакций

 Исходное состояние клеточного иммунитета характеризовалось лимфопенией с преимущественным снижением абсолютного и относительного содержания CD 8 лимфоцитов в 94 и 82,4% соответственно.

После курса Амиксина нормализация содержания CD 3 и CD 4 лимфоцитов наблюдалась в 35,3% случаев, а CD 8 – в 41,2%.

  Исходное состояние В-лимфоцитов (CD 20+) по относительным и абсолютным показателям характеризовалось умеренным увеличением их количества в периферической крови пациентов. После лечения процентное и абсолютное содержание клеток осталось практически на том же уровне.

Относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих на мембране антигены HLA -2 исходно было нормальным у 12 пациентов и оставалось таковым после лечения у 9 чел. Абсолютное число клеток до лечения было нормальным у 64% больных и несколько снизилось после лечения до 47%, т.е. имела место тенденция к уменьшению экспрессии лейкоцитарных антигенов 2-го класса на поверхности иммунокомпетентных клеток крови.

Индуцированная продукция ИЛ-2 (Т-клеточный ростовой фактор) была снижена у всех (16 из 17) пациентов до лечения и только у 6 из 15 –после лечения, т.е. имелась тенденция к усилению индукции ростового фактора.

Особый интерес представляет исследование провоспалительных цитокинов (ФНО-альфа и ИФН-гамма) и контравоспалительного интерлейкина (ИЛ-10) проведенное в динамике по трем точкам: до лечения, после завершения курса и спустя еще 2 недели.

  Исходный уровень спонтанной продукции ИЛ-10 был высоким (378,0+/-52,0 пг/мл, а ответ на индуктор (ФГА в дозе 50 мкг на мл) был снижен по сравнению с нормой (428,0+/-69,1 пг/мл). Индекс стимуляции равнялся 1,13.

После курса лечения Амиксином спонтанная продукция цитокина достоверно снижалась(259,0+/-59,7 против 378,0+/-52,0: p <0,05). Эта тенденция продолжалась и через две недели после завершения дачи препарата (170,0+/-27,9 против 378,0+/-52,0 до лечения: p <0,01).Индуцированная продукция снижалась незначительно, что приводило к увеличению индекса стимуляции: с 1,13 до 1,55 и 2,10 (401,0+/-68,1 непосредственно после курса лечения и 358,0+/-58,0 через две недели после завершения приема препарата против 428,0+/-69,1 до лечения).

При разделении больных на группы с легкой и средней степенью выраженности заболевания более существенное улучшение системы ИЛ-10 отмечено при легком и доброкачественном течении заболевания (индекс стимуляции достигал 6,54 против максимального индекса в 3,41 в группе со средней степенью выраженности РС).

  Влияние Амиксина на продукцию ФНО-альфа выражалось в снижении спонтанной продукции этого цитокина (28,6+/-6,8 пг/мл после курса p <0,05 и 18,7+/-5,4 пг/мл  p <0,05 через две недели после курса против 40,0+/-5,1 пг/мл до лечения). Индуцированная продукция ФНО-альфа под влиянием Амиксина увеличивалась с 134,0+/-39,0 пг/мл до 202,0+/-38,3 пг/мл после лечения,  p <0,05 и до 302,0+/-45,8 пг/мл, спустя еще две недели, p <0,05. В исходном положении довольно высоким было содержание сывороточного ФНО. Которое под влиянием Амиксина постепенно нормализовалось: до лечения-27,9+/-7,1 против 15,7+/-6,9 после лечения (p <0,05) и 3,8+/-1,6 через две недели после курса (p <0,01). При сравнении индуцированной продукции ФНО продигиозаном и ОБМ оказалось, что Амиксин несколько усиливал индукцию ФНО ОБМ (индекс стимуляции достигал 867% против максимального индекса в 300% по влиянием продигиозана).

  В результате лечения Амиксином больных РС наблюдалось достоверное снижение уровня сывороточного ИФН (21,8+/-1,2 до лечения и 20,5+/-0,5 после, p <0,05) и индуцированной продукции ИФН-гамма(116+/-22,9 МЕ до лечения и 95,1+/-15,0 после, p <0,02). Вместе с тем достоверного изменения индуцированной продукции ни в процентном, ни в абсолютном выражении ИФН альфа и бета не наблюдалось.

  Иммунологические реакции с мозгоспецифическими белками и митогенами проведенные до и после лечения Амиксином и в группе сравнения (лечение без Амиксина) в те же сроки показали положительную динамику специфического иммунитета у больных РС получавших Амиксин: улучшение супрессорной функции лимфоцитов и снижение сенсибилизации иммунокомпетентных клеток к глиальному и миелиновому антигенам. (Табл. 1)

  Таблица 1

Влияние Амиксина на специфический (противомозговой) иммунитет при рассеянном склерозе

  Верхняя строка- до, нижняя - после лечения, достоверность различий от 0,05 до 0,001

  В клиническом отношении по результатам действия Амиксин больные разделились на три группы: 1 гр. - 8 чел со средней степенью тяжести заболевания, выраженными двигательными ограничениями и умеренной прогредиентностью заболевания, в неврологическом статусе у этих больных обращали на себя внимание стигмы дегенерации: стопа Фридрейха, синкинезия Штрюмпеля, элементы подкорковых гиперкинезов (тики) 2 гр – 27 чел с легкой неврологической симптоматикой в фазе ремиссии и сопутствующими соматическими воспалительными заболеваниями (синуситы, аднексит, пиелонефрит, цистит, калькулезный холецистит, лабиальный герпес, хламидиоз, эндометриоз, простатит и пр.), у этих больных в неврологическом статусе были достаточно рельефными чувствительные расстройства и признаки заинтересованности нервной периферической системы (головные боли, лицевые боли, поясничные боли, штампующая походка вследствие сенситивной атаксии и периферической полинейропатии, амиотрофия бедра, парестезии в руках и ногах, ощущения стягивания вокруг пояса, гиперестезия по зонам Зельдера, нейросенсорная тугоухость). В анализах у некоторых больных регистрировалась ускоренная СОЭ, лейкопения, анемия, повышение ЦИК, при производстве МРТ визуализировался отек вокруг зон гиперинтенсивного сигнала, а при МРС – пик резонанса в зоне липидов. Все это позволяло квалифицировать инфекционно-аллергический патогенез заболевания. 3 гр – 7 чел отличались жалобами общего характера: утомляемость, тревожность, раздражительность, снижение памяти, отсутствие инициативы. При психологическом тестировании у них выявлялись невротическая астения, депрессивный синдром, реактивная и личностная тревога, умеренное интеллектуально-мнестическое снижение с элементами эйфорической деменции.

Больные по разному реагировали на применение Амиксина.

В первой группе не отмечалось существенной субъективной и объективной динамики клинического состояния.

Во второй группе больные сообщали об улучшении самочувствия, уменьшении чувствительных и тазовых расстройств, увеличении двигательных возможностей. Объективно при неврологическом обследовании отмечено появление брюшных рефлексов, снижение пирамидного гипертонуса, улучшение выполнения проб на балансировку и координацию, прекращение болей при прессации точек выхода тройничного нерва, паравертебральных точек пояснично-крестцовой области, удлинение времени восприятия камертона с кистей и стоп.

В третьей группе больные подчеркивали повышение работоспособности, настроения, живости восприятия окружающего, они заявляли, что «никогда себя так хорошо не чувствовали». По шкале Спилбергера-Ханина зарегистрировано уменьшение реактивной тревожности с 45,6 +/-1,2 до 42,9+/-2,7 и даже до 37,9+/-1,2.

Обсуждение

Амиксин снижает повышенное содержание сывороточных ИФН, свидетельствующее о напряжении интерфероновой защиты  у данного контингента больных, и достоверно подавляет индукцию гамма-ИФН – провоспалительного иммунного цитокина, имеющего стимулирующее влияние на клетки продуценты нейротоксического фактора ФНО-альфа. В результате этого снижается концентрация ФНО-альфа в сыворотке крови больных, уменьшается спонтанная продукция этого цитокина, что устраняет глиотоксическое состояние мозга и затрудняет проницаемость ГЭБ для аутоагрессивных клонов Т-клеток крови. Снижение воспалительной активности крови (и, возможно, ликвора) позволяет нормализоваться механизмам контравоспаления, в частности, ИЛ-10, находящимся до этого в состоянии искаженного напряжения, когда преобладала спонтанная продукция цитокина над индуцированной. Постепенно в течение двух недель после курса Амиксина индекс стимуляции интерлейкина-10 нормализуется. При этом снижается сенсибилизация клеток крови к глиальному(S -100) и миелиновому (ОБМ) антигенам. В клиническом отношении наблюдается уменьшение субъективных и объективных признаков воспалительного компонента заболевания: уменьшение болей, улучшение проводимости периферических нервов, снижение спастичности, уровня тревожности, исчезновение парестезий. Нормальное состояние системы ИЛ-10 позволяет обеспечить защиту при угрозе возникновения или обострения вирусных и бактериальных заболеваний у лиц с РС (ОРЗ, грипп, обострение хронического тонзиллита и пр.), что предупреждает сезонные экзацербации основного заболевания РС. Продолжающееся наблюдение за больными в течение всего весеннего сезона позволило обратить внимание на профилактическое влияние проведенного курса Амиксина в отношении заболеваемости ОРЗ: никто из 42 чел. не заболел ОРЗ, хотя предыдущий сезон у 16 из них. были клинические проявления ОРЗ и у 4-х из 16 имело место ухудшение неврологической симптоматики. В группе сравнения (РС без Амиксина) 4 чел из 10 перенесли выраженные ОРЗ с высоким подъемом температуры и легочными осложнениями. Известно, что вирусиндуцированное обострение РС встречается у 70% больных и у 37,5% из них это сопровождается усилением демиелинизации, а у 49,2% регистрируется воспалительная реакция ликвора. (В.И.Головкин, 1993; Т.С.Матвеева, 1986).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование показало положительное влияние Амиксина на клинико-иммунологические показатели у больных РС в 70-82% случаев. Клиническая субъективная и объективная симптоматика заболевания улучшалась преимущественно при инфекционно-воспалительном (нейроаллергическом) патогенезе заболевания. Не получено клинического эффекта в 18% случаев с преимущественно нейродегенеративным патогенезом заболевания сочетающегося с более грубым поражением ЦНС и признаками атрофии ткани на МРТ.

При анализе материала вскрыт новый иммунологический механизм действия Амиксина и выявлено его продолжающееся отстроченное действие в течение, по крайней мере, 2-х недель (срок наблюдения) после прекращения приема препарата.

  Амиксин как антиоксидант.

  В процессах аутоиммунной демиелинизации участвуют факторы, избыточная экспрессия которых оказывает цитотоксическое действие на ЦНС, в частности путем образования эйкозаноидов. В то же время известно, что эйкозаноиды и регуляторные пептиды регулируют синтез СОД. Таким образом, создаются условия для развития взаимосвязанного аутоиммунно-патохимического процесса, затрагивающего иммунокомпетентные клетки, астроглию, олигодендроциты и миелин. Процесс поддерживается генерацией свободных радикалов, которые повреждают белки, создавая новые антигенные детерминанты. Подтверждением данной гипотезы, связывающей иммунодефицитный и свободно-радикальный механизм развития РС, являются результаты исследования, в котором показано снижение продукции NO клетками астроцитомы человека под действием бета-интерферона.

Ранее Г.А.Вилков и соавторы показали эффективность токоферола в коррекции ПО и нейроиммунных процессов при ЭАЭ. Клинические исследования выявили связь патологии двигательных нейронов с дефектом гена СОД, а также дисбаланс в системе ПО-АОС у больных РС. Следовательно, включение антиоксидантов в схему лечения пациентов, страдающих рассеянным склерозом, является обоснованным не только с позиций общей патологии, но и с учетом клиники конкретной нозологической формы. Известно также, что в течение первого года болезни АОС имеет достаточную мощность и обеспечивает спонтанные ремиссии заболевания; в разгар болезни и бурного разрушения миелина активность пероксидазы и каталазы эритроцитов падает и это приводит через 5-7 лет к прекращению ремиссий. На поздних стадиях РС, когда преобладает вторичная дегенерация аксонов с необратимым блоком проведения нервных импульсов, а воспалительная демиелинизация выражена в меньшей степени показатели СРО и активности антиоксидантных ферментов существенно не изменяются. В позднем возрасте (после 42 лет у женщин и после 48 лет у мужчин) наблюдается естественное падение антиоксидантной защиты т.н. онтогенетический оксидантный стресс и создается впечатление прогрессирования заболевания. Эстрогены больше связаны с АОС, чем андрогены, поэтому у женщин наблюдается выраженная флуктуация симптомов заболевания. Учитывая эти факты, для исследования функции АОС были отобраны молодые женщины с небольшим сроком заболевания, находящиеся на амбулаторном режиме наблюдения и сохраняющие ремиттирующее течение заболевания.

В связи с вышеизложенным небезынтересным являлось определение влияние Амиксина на антиоксидантную систему организма больных РС.

В сыворотке крови до и после курса Амиксина исследовались следующие показатели состояния антиоксидантной системы: супероксиддисмутаза(СОД)  ключевой фермент, катализирующий обезвреживание супероксидного аниона- основного продукта свободно-радикального окисления.(Вопр.мед.химии,1977,5,712-717);

каталаза (КАТ) – фермент, расщепляющий перекись водорода, которая образуется из супероксидных радикалов. (Современные методы в биохимии, М.,1977); диеновые конъюгаты (ДК) – первичные продукты перекисного окисления липидов, развивающегося под действием свободных радикалов кислорода.

( Bergmeyer , Methods in enzymology , NY , 1994); малоновый диальдегид (МДА)– один из конечных продуктов перекисного окисления липидов. (Вопр. мед. химии,1987,1,118-122).

 В результате исследования показано, что активность СОД после лечения возросла в среднем на 16,1%, а содержание ДК снизилось в среднем на 12,1%, т.е. Амиксин умеренно увеличивает супероксиддисмутазную активность крови, что сопровождается снижением концентрации первичных продуктов ПОЛ в сыворотке крови. Поскольку СОД является ключевым ферментом, катализирующим обезвреживание супероксидного аниона, то Амиксин следует признать препаратом, обладающим антиоксидантным действием.

Литература:

1. Акимов Г.А.,Головкин В.И.,Чижов Н.П. Влияние индуктора интерферона тилорона на клинические и иммунологические показатели у больных рассеянным склерозом. В кн. Антивирусные вещества, Минск,1984,-С.85-86

2. Ершов Ф.И., Баткаев Э.А., Головкин В.И., Киселев О.И., Турьянов М.Х. Амиксин: применение в терапии острых и хронических вирусных заболеваний (рекомендации для врачей), М.: “ЛЭНС”,1998.-20с.

3. Ершов Ф.И., Чижов Н.П., Тазулахова Э.Б. Противовирусные средства (справочник), СПб.,1993.-104с.

4. Матвеева Т.С. Миелинотоксическая активность сыворотки у больных рассеянным склерозом // Ж. невропатолог. и психиатр., 1986.-С.528-531

5. Головкин В.И. Диагностика и патогенетическая терапия рассеянного склероза. Дисс…..докт. мед.наук. СПБ,1992

6. Гусев Е.И., Демина Т.Л., Бойко А.Н. Рассеянный склероз,М.:“Нефть и газ”,1997.-468с.

7. Chen Y., Kuchroo V., Inobe J-I. et al.Regulatory T-cell clones induced by oral tolerance suppression of autoimmune encephalomyelitis.Science,1994.-265.-P.1237-1240

8. Levine S., Sowinski R., Abreu SL. Suppression of EAE by Tilorone: Cell transfer and Interferon Studies. Immunopharmacology,1983.-v.6.-N1.-P.23-31

9. Link J., Soderstrom M., Olson T. Et al. Increased transforming growth factor-b, interleukin-4 and interferon-g in multiple sclerosis. Ann Neurol, 1994.-36.-P.379-386

10. Miller A., Lnir N., Shapiro S. et al. Immunoregulatory effects of interferon-b and interacting cytokines on human vascular endothelial cells. Implication for multiple sclerosis and other autoimmune diseases. J. Neuroimmunol,1996.-64.-P.151-161

11. Nagelkerken L.Therapeutic potential of cytokines in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis.// Proc. conf. ”Neuroimmunol., Neuroinfect., Neuroimaging”, SPb,1995.-P.81

12. Navikas V.,Link J.,Palasik W.et al. Increased mRNA expression of IL-10 in mononuclear cells in multiple sclerosis and optic neuritis. Scand. J. Immunol.,1995.-41.-P.171-178

13. Sasaki H., Pollard RB,Schmitt D.,Suzuki F.,Transforming growth factor-b in the regulation of the immune response.Clin. Immunol.Immunopathol.,1992.-65,-P.1-9

14. Selmaj K.,Raine CS.,Cannella B.,Brosman CF.,Identification of lymphotoxin and tumor necrosis factor in multiple sclerosis lesions. J. Clin.Invest.,1991.-87.-P.949-954

15. Selmaj K.,Raine CS.,Cross AH. Anti-tumor necrosis factor therapy abrogates autoimmune demyelination. Ann Neurol.,1991.-30.-P.694-700

16. Shneider M.A.,Golovkin V.I. Interferon inductors for complex chemotherapy of chronic and slow neuroviral infections in man// Abstr.YII simp.”Antiviral substances”,Varna, 1987.-P.64.

17. Соколовский В.В., Шлейкин А.Т. Роль окислительно-восстановительных процессов в организме при действии повреждающих факторов/ В кн.: Живые системы под внешним воздействием. СПб : РАН , 1992: 132-6.

18. Shleikin A. The antioxidants in diagnosis and prevention of age-related dementia. EGPRW . Bergen , 1998: 22.

19. Вилков Г.А., Степаненко Е.М., Крыжановский Г.Н.. Влияние витамина Е и тималина на развитие ЭАЭ. БЭБМ , 1987; 9: 288-90.

20. Mitchel JD. Cu/Zn Superoxide dismutase, free radicals and motor neurone disease. Lancet 1993; 342: 1051.

21. Щипицина Н.А., Показатели антиоксидантной защиты у больных рассеянным склерозом. [Автореф дисс ... канд мед наук]. Пермь, 1998. 19 c с.

22. Чумаков В.Н.,Осинская Л.Ф. Количественный метод определения активности цинк-медь зависимой СОД в биологическом материале. Вопр. мед. химии 1977; 5: 712-7.

23. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Топорев В.Е. Метод определения активности каталазы. Лабораторное дело 1988 ; 1 : 16-9 .